"Экспрессия и прогноз ZAP-70 при хроническом лимфоцитарном лейкозе
СТАТЬИ
Дженни Э. Орчард, Рейчел Э. Ибботсон, Зейди Дэвис, Адриан Уистнер, Андреас Розенвалд, Питер И.Томас, Терри Дж. Хэмблин, Луис М. Стаут, Дэвид Дж. Осайер

Резюме
Фоном хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ) являются гетерогенные заболевания; многие пациенты никогда не получали лечения, в то время как у некоторых имеются неудовлетворительные результаты. Новые процедуры, могущие вызвать полную ремиссию, позволяют пациентам с плохим прогнозом лечиться до появления симптомов. Наличие или отсутствие мутации гена IgVH является наилучшим показателем клинического исхода, но этот анализ не приспособлен к обычной лаборатории. Ген, кодирующий ZAP-70, белок тирозинкиназы, обычно выявляется в T- и NK-клетках, как было показано, с помощью генно-экспрессионного анализа сывороточного спектра антител, чтобы по-разному проявиться у пациентов с мутантными и неизменёнными генами IgVH. Мы оценили, может ли ZAP-70 использоваться в качестве прогностического маркера при ХЛЛ.

Методы. Мы разработали проточно-цитометрический анализ для экспрессии белков ZAP-70 и исследовали её сочетание с экспрессией мРНК ZAP-70, мутационный статус генов IgVH и клинические исходы у 167 пациентов с ХЛЛ.

Результаты. Мы показали высокое соответствие между выявлением белков ZAP-70 и генными мутациями IgVH. У 108 пациентов (65%) были мутантные гены IgVH и ZAP-70-отрицательная реакция; 46 (28%) имели неизменённые гены IgVH и были ZAP-70-положительными. 13 пациентов дали противоречивые результаты: у шести (4%) были мутантные гены IgVH, но они были ZAP-70-положительны, а семеро (4%) имели неизменённые гены IgVH и были ZAP-70-отрицательны. Экспрессия мРНК показала 97%-ное соответствие с белком ZAP-70. Медиана выживаемости пациентов была от 24 до 4 лет (95% Cl 15-1-33-8) у ZAP-70-отрицательных пациентов и от 9 до 3 лет (7-0-11-5) у ZAP-70-положительных (соотношение рисков 5-5, 2-8-10-8).

Расшифровка белка ZAP-70, который можно измерить методом проточной цитометрии в общей лаборатории, является надёжным прогностическим маркером при ХЛЛ, эквивалентным мутационному статусу гена IgVH.

Lancet 2004; 363: 105-11

Введение
Клиническое течение хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ) является неоднородным: многие из пациентов страдают вялотекущей формой заболевания, не нуждающейся в лечении, а у других наблюдается агрессивный клинический исход.¹ Бессимптомные пациенты с малыми новообразованиями (Бине, стадия А) не получают никакой пользы от лечения хлорамбуцилом.^2,3 Однако новые препараты, такие как флударабин и алемтузумаб, способные вызвать полную ремиссию, могут сделать возможным лечение на ранних стадиях бессимптомных пациентов, чья болезнь, вероятнее всего, будет прогрессировать.⁴ Точная идентификация данных пациентов имеет поэтому всё большее значение.

Оба маркера неблагоприятного прогноза, как на стадии А, так и при развивающемся ХЛЛ, включают отсутствие мутаций в вариабельной области тяжёлой иммуноглобулиновой генной цепи (ген IgVH) ^5,6 делецию хромосомы llq23, потерю или мутацию гена p53, CD38-положительность, и повышают концентрацию сывороточных маркеров, таких как тимидиновая киназа ^7-10. В многомерных статистических анализах мутационный статус гена IgVH является лучшим определителем клинического исхода: прогноз пациентов, чья ХЛЛ имеет неизменённые гены IgVH, значительно хуже, чем у тех, чьи гены IgVH претерпели соматические мутации (медиана выживаемости у одних 6-6-9-9 лет и соответственно 24 года у других).^5-8 Однако оба анализа на мутации являются дорогими и трудоёмкими, исключающими их повседневное использование.
Генно-экспрессионное профилирование с помощью микроматричных анализов на кДНК использовалось при ХЛЛ для сравнения пациентов с мутантным геном и неизменённым геном IgVH. В двух первоначальных исследованиях ^1,2 генетические коды двух ХЛЛ-групп были показаны как аналогичные. Тем не менее, около 30 генов продемонстрировали сильную дифференциальную экспрессию в системе анализа «Лимфочип»³.
Экспрессия гена с кодом ZAP-70, белка тирозинкиназы, незаменимого в Т-клеточной сигнализации, но не обнаруживаемого в нормальных В-клетках, была в пять раз выше у больных с неизменённым геном IgVH, чем у тех, чьи гены мутировали, и была лучшим индикатором между двумя группами.

Мы стремимся развивать проточно-цитометрический анализ для экспрессии белка ZAP-70, чтобы оценить, насколько дифференциальная генная экспрессия ZAP-70 согласуется с разницами в экспрессии белка, имеет ли экспрессия белка ZAP-70 прогностическое значение для ХЛЛ, и в какой степени белок может быть использован в качестве заменителя для мутационного статуса генов IgVH.

Методы.
Пациенты и образцы.

Мы исследовали 167 пациентов с ХЛЛ от общего числа 608, наблюдавшихся в Борнмуте в период с октября 1983 года по июль 2002 года; единственным критерием отбора было наличие свежих или диметилсульфоксид-замороженных клеток. Все пациенты давали письменное согласие на участие в исследовании, утверждённом местным этическим комитетом. Диагноз ХЛЛ ставился на основе стандартных морфологических и иммунофенотипических критериев.¹⁴ Стабильность заболевания и летальные исходы, связанные с болезнью, оценивались так же, как и описанные ранее.⁸
В нескольких словах, прогрессирующее заболевание было определено как усугубление стадии, со сроком удвоения лимфоцитов менее 12 месяцев, или как системные В-симптомы, вызвавшие необходимость лечения. Некоторые пациенты лечились после долгого периода ожидания и наблюдения, как правило, по лейкоцитарной формуле крови, которая медленно увеличивалась более чем на 100-200 X109/л, без соответствия критериям прогрессирования заболевания. Эти пациенты были обозначены как медленно прогрессирующие. На 123 выживших, средний срок от момента постановки диагноза до смерти составлял 7-3 лет, нижний квартиль - 3-8 лет, верхний квартиль - 11-5 лет). Все образцы от пациентов, получающих лечение, были взяты как минимум спустя 3 месяца после последней процедуры.

Мы измерили ZAP-70 как в свежих, так и в замороженных клетках 25 пациентов, и результаты были соответственными. У 20 пациентов мы измерили ZAP-70 в последовательных пробах. По крайней мере, 10^s свежеотделённых ХЛЛ-клеток были необходимы для микроматричного анализа кДНК; это количество было доступно для 64 других невыбранных пациентов, и, следовательно, мы смогли получить данные об экспрессии мРНК ZAP-70 и одновременной об экспрессии белка ZAP-70 для этой группы. В-лимфоциты пятерых здоровых взрослых человек были также отделены и проанализированы на экспрессию белка ZAP-70.

Рис. 1: Точечные области из проточной цитометрии, показывающие экспрессию белка ZAP-70 у типичных пациентов

Пациент 1: ZAP-70-отрицательный, ген IgVH мутантный.(A) Боковое рассеяние (SSC-H) в сопоставлении с изотипическим контролем (IGG2a FITC).

(B) Боковое рассеяние против ZAP-70 FITC.(C) CD3-PE в сопоставлении с ZAP-70 FITC.

Пациент 2: ZAP-70-положительный, ген IgVH не изменён.
(A) Боковое рассеяние в сопоставлении с изотипическим контролем.
(B) Боковое рассеяние в сопоставлении с ZAP-70 FITC.
(C) CD2-PE в сопоставлении с ZAP-70

FITC подтверждает, что популяцией R2 являются T- и NK-клетки.

Рисунок 2 - Экспрессия белка ZAP-70 и мРНК у пациентов с мутантным и неизменённым геном IgVH
мРНК ZAP-70 передаётся как экспрессия мРНК, связанная с log₂

Процедуры
Чтобы определить ZAP-70 методом проточной цитометрии, лимфоидные клетки из периферической крови (163 пациента), костного мозга (один пациент), или распавшейся лимфоидной ткани (три пациента) были разделены средой для фракционирования лимфоцитов и оба использовались в свежем виде, либо замороженными в диметилсульфоксиде и впоследствии размороженными. Мы разместили 5X106 клеток в 0-5%-ном параформальдегиде на 30 мин, промыли их фосфатно-солевым буферным раствором, содержащим 0-05% твина и 2% человеческого сывороточного альбумина, и хранили их в 80%-ном этаноле при -20°C сроком от 24 часов до 4 недель. Клетки промыли тем же буфером перед выдерживанием с первичным антителом (ZAP-70, клон 2F3-2, «Сверхштатные биотехнологии», Милтон Кейнс, Великобритания) или 20-минутным изотипическим контролем (мышиный IgG2a, Дако, Эли (Великобритания), за которым следует вторичное антитело (овечья анти-мышиная конъюгата флуоресцеинизотиоцианата (FITC, «Новокастра», Ньюкасл-Апон-Тайн, Великобритания) на 15 минут. По крайней мере 5000 клеток были получены в ходе клеточно-исследовательской программы на проточном цитометре FacsCalibur Бектона Дикинсона.
ХЛЛ-клетки, являющиеся ZAP-70-положительными, окрашиваются равномерно и постепенно более слабо, чем Т- и NK-клетки, которые легко можно определить как отдельную, интенсивно окрашивающуюся популяцию, которая у ZAP-70-отрицательных пациентов обеспечивает полезный положительный контроль за жизнедеятельностью антител. Т- и NK-клетки были синхронизированы, и эта величина была вычтена из общего ZAP-70-положительного населения, чтобы получить значение ХЛЛ-клеток. Мы использовали этот одноцветный анализ для большинства образцов, но проверили процесс закрытия путём добавления антитела с двухцветной поверхностью (CD3-PE или CD2-PE, Дако, 2 (µL раствора 1:5) у 30 пациентов, включая всех тех, у кого возможное заражение T- или NK-лимфоцитов (известное по одновременному иммунофенотипированию) могло повлиять на результат. Рисунки 1C и 2C показывают результаты в группах, которые соответственно были ZAP-70-отрицательными и ZAP-70-положительными.
Мы измерили CD38 на ранее описанной трёхцветной технике.¹⁵ В нескольких словах, мы измерили пропорции клеток, дающих позитивную реакцию на CD38 (HB-7 PE, Бектон Дикинсон, Оксфорд, Великобритания) в опухолевой клеточной популяции, определённой синхронизацией на передне-боковом рассеянии, и последовательно на лимфоцитах (CD5 FITC)+/(CD19 PE-Су5)+. Соответствующий изотипический контроль был проведён во всех случаях. Мы указывали на значение 30% или большее как на CD38-положительный результат, на основании установленных ранее критериев.¹⁵
Мы упорядочили гены IgVH как ранее описанные.⁶ Вкратце, переменная область была амплифицирована ПЦР-методом со смесью 5'-феромонных олигонуклеотидов, специфичных для каждого ведущего ряда VH-семейств 1-7, вместе с постоянными 3'-феромонными областями или 5'-феромонной системой соединения 1 и 3"-феромонного соединения JH. ПЦР-продукты были очищены (Квиаген, Кроули, Великобритания) и непосредственно упорядочены автоматизированным DNA-секвенсером (ABI 377/310, Прикладные биосистемы, Фостер-Сити, США). Последовательности нуклеотидов были выровнены ЕМБЛ/Генным банком и V- BASE¹⁶ путём использования MacVector 4.0 (Международные биотехнологии, Нью-Хейвен, США), или Lasergene (DNASTAR, Мэдисон, США) последовательным анализом программного обеспечения. Как было условлено прежде, 98%-ная или большая предельная концентрация зародышевой гомологии определила группу с неизменённым IgVH. Этот предел был установлен, чтобы допустить возможность 2%-ного отклонения зародышевой последовательности, возникающего скорее из-за полиморфизмов, нежели от соматических мутаций.
Методы микроматричного анализа кДНК были подробно описаны в других источниках.^17,18 В нескольких словах, ХЛЛ-клетки были очищены магнитным отбором для CD 19+ клеток (Miltenyi Biotec, Бергиш-Гладбах, Германия) при температуре 4°C и были заморожены в течение 6 часов после забора крови, до экстракции мРНК (Ускоренный режим, Инвитроген, Пейсли, Великобритания) и анализа микрочипов. CD 19 отбор обычно даёт результат с более чем 98%-ной точностью, чем измерения методом проточной цитометрии. Флуоресцентно помеченные кДНК-зонды были получены из мРНК; краситель Cy-5 использовался для обозначения кДНК в ХЛЛ-образцах, а краситель Cy-3 – для метки кДНК из ссылки на резерв мРНК, приготовленного из девяти лимфомных клеточных линий. Микрочипы кДНК «Лимфочип», содержащие 13 868 человеческих кДНК, были приготовлены и использовались, как описано ранее.^12,18 Мы основывали первоначальный отбор микроматричных данных на интенсивности флуоресцентного сигнала, с требованием 50 относительных флуоресцентных единиц выше фона в обоих каналах Cy-3 и Cy-5, или 500 относительных флуоресцентных единиц выше фона в одном отдельно взятом канале. Между экспрессией мРНК ZAP-70 в этом микрочипе и в режиме реального времени количественным методом ПЦР была показана хорошее взаимодействие (коэффициент Пирсона r=0-901).¹³

Рис. 3 - Экспрессия белка ZAP-70 в сопоставлении с мутационным статусом генов IgVH

П=прогрессирующее заболевание.
МП=медленно прогрессирующее заболевание.
С=стабильное заболевание.
У стабильных пациентов длительность наблюдения в годах показана в скобках.
Таблица 1: данные о пациентах со спорными результатами

Статистический анализ

Нами был проведен анализ данных с помощью SPSS (версия 10) с 5%-ным уровнем значения. Данные по времени от постановки диагноза до смерти были проанализированы по кривой выживаемости Каплана – Мейера. Сравнение кривых выживаемости между двумя или более группами пациентов были сделаны с помощью логранговых критериев. Мы использовали индекс Юдена¹⁹ для оценки оптимальной предельной точки для положительных результатов ZAP-70 методом проточной цитометрии. Поскольку многие показатели выживаемости являются взаимосвязанными, метод пропорциональной регрессии рисков Кокса был использован для расчёта урегулированных и неурегулированных отношений риска для каждого фактора, вместе с 95% противопоказаний.
Взаимодействия первого порядка между факторами были также проверены, и ни одно из них не оказалось значительным. Мы оценили восприимчивость, специфичность, положительные прогностические значения, а также отрицательные прогностические значения, чтобы обобщить, насколько тесно результаты ZAP-70 теста связаны с золотым стандартом генного тестирования IgVH.

Роль источника финансирования
Заказчик клинического исследования не играл никакой роли в плане исследования, сборе данных, анализе данных, расшифровке данных, написании отчёта или в решении предоставить рукопись для публикации.
Результаты:
102 пациентов (61%) были мужского пола; их средний возраст на момент постановки диагноза был 67 лет (нижний квартиль 53, верхний квартиль 76). На момент первичного осмотра у 143 пациентов (86%) была стадия А по Бине, у 12 (7%) – стадия В, у семи (4%) – стадия С, и у пяти (3%) - неизвестная. Наиболее общими цитогенетическиями аномалиями являлись: доказательства или утрата р53-мутации у шести пациентов (4%), делеция llq-хромосомы у 14 пациентов (8%), 12-трисомия у 49 пациентов (29%), 13q-делеция у 71% пациентов (43%); 13q-делеция была единственным отклонением от нормы у 50 (30%). Гены IgVH мутировали у 114 пациентов (68%) и остались неизменёнными у 53 (32%); наконец, 42 (25%) показали 100%-ную гомологию зародышевого пути. Данные CD38 были доступны у 162 пациентов; 59 (36%) были положительными и 103 (64%) - отрицательными. Стабильность заболевания была исследована у 164 пациентов: оно было стабильным у 87 пациентов (53%), прогрессирующим у 42 (26%), и медленно прогрессирующим у 35 (21%). 92 пациентов (55%) никогда не получали лечения, и у 75 (45%) было отмечено прогрессирование заболевания, что потребовало лечения на определённой стадии в течение последующего наблюдения. Имелось 42 летальных исхода (25%), из которых 22 были связаны с ХЛЛ.
В нашей оценке экспрессии белка ZAP-70 использовались два различных подхода для определения оптимальной предельной точки для ZAP-70-положительности методом проточной цитометрии на 10%. Во-первых, индекс Юдена¹⁹ был рассчитан на всех пациентов для оптимизации восприимчивости и специфичности ZAP-70 в разграничении между мутантными и неизменёнными генами IgVH. Этот метод определяет величину предельной концентрации между 10% и 15%. Во-вторых, по микроматричному анализу кДНК у 47 пациентов были признаны отрицательные значения экспрессии мРНК ZAP-70 (см. ниже).

Таблица 2: Отношение рисков для воздействия белка ZAP-70, CD38
и статуса гена IgVH на выживаемость

Для соответствующих замеров проточной цитометрии процент клеток показывает большую экспрессию, чем было определено отрицательным контролем: средний процент был 2-69% (SD 2-27). Это даёт значение 9-5% для среднего +3 SD, обычной предельной концентрации для проточной цитометрии.²⁰ Типичная точечная диаграмма для ZAP-70-положительных и ZAP-70-отрицательных пациентов показана на рисунке 1. Пять образцов очищенных B-лимфоцитов от здоровых людей все демонстрируют значения ZAP-70 менее 10%, в соответствии с предыдущими выводами, что нормальные В-клетки не экспрессируют ZAP-70.²¹ Серийные замеры ZAP-70 были выполнены у 20 пациентов (из них 14 человек ZAP-70-положительны, шестеро - ZAP-70-отрицательны) за средний 29-месячный период (в пределах 12-48). У одного пациента в течение 24-месячного периода наблюдения значение изменилось с менее 10% до 15%; у остальных 19 пациентов значения не превышали предела 10%. У девяти пациентов (из них пятеро ZAP-70-положительны, четверо ZAP-70-отрицательны), образцы крови и лимфатических узлов которых были доступны, в обеих видах ткани были получены аналогичные ZAP-70. Мы получили замеры экспрессии мРНК ZAP-70, как отмечено в схеме, относительной экспрессии мРНК у 64 пациентов. У 17 пациентов (27%) мРНК была overexpressed и в 47 (73%) мРНК была низкой или отсутствовала. Сравнение экспрессии мРНК ZAP-70 и экспрессии белка ZAP-70 методом проточной цитометрии в этой группе из 64 пациентов показана в рис. 2. У 62 пациентов (97%), не было согласования между ZAP-70 экспрессии мРНК и ZAP-70 белка выражение. У двух пациентов мРНК ZAP-70 была с повышенной экспрессией, но экспрессия белка была отрицательной; у одного из этих пациентов имелся мутантный ген IgVH, а у другого нет. Отношения между экспрессией белка ZAP-70 и мутационный статус генов IgVH показаны на рис. 3. 108 пациентов (65%) имели мутантные гены IgVH и были ZAP-70-отрицательными. 46 пациентов (28%) имели неизменённые гены IgVH и были ZAP-70-положительными, дающие конкордантность 92% (95% Cl 87-95). Шесть (4%) пациентов имели мутантные гены IgVH, но были ZAP-70-положительными, и семеро (4%) имели неизменённые гены IgVH и были ZAP-70-отрицательными. Детали 13 этих несходных образцов приведены в таблице 1. У всех пациентов 1-6 был пограничный мутационный статус, из них пятеро показали 97%-ную зародышевую гомологию, а шестой, с 96%-ной гомологией показал сегмент гена VH 3-21, имеющий отношение к плохому прогнозу^{. 22} У пятерых из шести было прогрессирующее или медленно прогрессирующее заболевание. Пациенты 7-13 имели неизменённые гены IgVH, но были ZAP-70-отрицательны (подтверждены данные экспрессии мРНК у трёх пациентов). Пять пациентов имели прогрессирующее или медленно прогрессирующее заболевание, и двое были стабильными. Для всех 143 пациентов, которые представлены на стадии заболевания А, мы сравнили прогностическую ценность ZAP-70-положительности с ценностью неизменённых генов IgVH. 43 пациента, получившие прогрессирующее или медленно прогрессирующее заболевание, могут быть правильно идентифицированы по наличию неизменённых генов IgVH, а четыре пациента, имеющие стабильное заболевание более чем за 5 лет наблюдения, были неправильно классифицированы данным маркером. Соответствующей цифрой для ZAP-70-положительности была 44 и, соответственно, четыре пациента. Конкордантность между CD38 и мутационным статусом гена IgVH была показана у 122 из 162 пациентов (75%; 95% Cl 68-81), а экспрессия белка ZAP-70 – соответственно, у 121 из 162 пациентов (75%; 68-81). Медиана выживаемости была 9-3 года (95% Cl 7-0-11-5) у ZAP-70-положительных пациентов и 24-4 года (15-1-33-8) у ZAP-70-отрицательной группы (p<0,0001; рис. 4а и б).

Когда только все случаи смертности, связанные с заболеванием, были исключены, соответствующие значения стали 10-7 лет (6-8-14-5) и 25-8 лет (95% Cl не может быть рассчитана, потому что там нет никаких последующих смертей), соответственно (p<0-0001). Медиана выживаемости была 24-4 года (95% Cl 15-1-33-7) у пациентов с мутантным геном IgVH и 9-8 лет у тех, кто не имел мутации (p<0,0001, рис. 4C). Значит, средняя выживаемость была 24-0 лет (95% Cl 17-2-30-8) у CD38-отрицательных пациентов и 13-6 лет (9-4-17-7) у тех, кто был CD38-положительным (p=0-008; рис. 4D). Скорректированные и нескорректированные отношения риска для ZAP-70, CD38 и мутационного статуса генов IgVH приведены в Таблице 2. В одномерном анализе ZAP-70 и статуса гена IgVH было показаны как сильные прогностические факторы выживания, и CD38 также был значительным. Корректировка ZAP-70 для CD38 привела к весьма незначительным изменениям в отношении рисков для ZAP-70, но CD38 больше не было значительным; аналогичные результаты применяются при корректировке мутационного статуса гена IgVH в сопоставлении с CD38. Образцы пропорциональных рисков, в том числе оба ZAP-70 и статус гена IgVH не представлен, поскольку высокая степень конкордантности между двумя факторами означает, что каждый из них становится незначительным, если скорректирован для другого.

Обсуждение
Мы профилировали генную экспрессию в очищенных лимфоцитах у 107 пациентов с ХЛЛ и показали высокую степень конкордантности между экспрессией мРНК ZAP-70 и мутационным статусом гена IgVH; 3 маркера были схожи в своей способности определять подгруппы пациентов с кратким лечением - свободным выживанием. Мы разработали проточно-цитометрический анализ, в котором заражающие T- и NK-клетки могут быть идентифицированы путем высокой интенсивности ZAP-70 в этих клетках по сравнению с ХЛЛ-клетками. Наши выводы свидетельствуют о тесной взаимосвязи между экспрессией мРНК ZAP-70 и белка, а также между экспрессией белка ZAP-70 и мутационным статусом генов IgVH. Кроме того, как экспрессия белка ZAP-70, так и мутационный статус генов IgVH являлись сильными показателями общей выживаемости. CD38, который мы также измеряли методом проточной цитометрии, имел слабую прогностическую ценность в одномерном анализе, но не увеличил предсказательную силу ни ZAP-70, ни мутационного статуса генов IgVH в многофакторном анализе. Система типологии больных по ДСГ в настоящем исследовании находится скорее в главной районной клинике, а не в третьеразрядном медицинском центре, и преобладание пациентов со стадией А вялотекущего заболевания способствует длинной медиане выживаемости (24 года) в ZAP-70-отрицательной группе. Кроме того, конкордантность между экспрессией белка ZAP-70 и мутационным статусом гена IgVH может быть восстановлена последовательно с меньшим количеством вялотекущих случаев, поскольку согласованность была особенно хорошей у пациентов с множественными мутациями. Однако этот проточно-цитометрический анализ хорошо подходит для применения в главной районной клинике, в которых можно было бы ожидать направления в структуры, похожие на нашу собственную. Аналогичное исследование экспрессии белка ZAP-70, измеренной методом проточной цитометрии, было учтено Креспо и его коллегами²³, использовавшими те же антитела, что и в настоящем исследовании, и исследовавшими 56 пациентов с ХЛЛ, из которых 32 (63%) имели неизменённые гены IgVH. Они также показали сильное взаимодействие между экспрессией белка ZAP-70 и мутационным статусом генов IgVH, хотя эффекта ZAP-70-положительности на продолжительность существования достигло значение в подгруппе пациентов, которые находились на стадии заболевания А на момент установления диагноза. Особый интерес в обоих представляют индивидуумы, у которых противоречивы данные мутационного статуса генов IgVH и экспрессии ZAP-70. В нашем исследовании, пять из шести пациентов с экспрессией ZAP-70 и мутантными генами, имели 97%-ную гомологии в зародышевом пути, и один (на основании плохого прогноза гена V3-21) имел 96%-ную гомологию. Будет считаться, что эти пациенты имели плохой прогноз по исследованиям, в которых либо 95%-ная, либо 97%-ная гомология используются для определения прогностических подгрупп. Все пациенты в обоих исследованиях с менее чем 96%-ную гомологией не дали экспрессии ZAP-70, подчёркивая взаимосвязь между экспрессией ZAP-70 и скорее низкой мутационной нагрузки, нежели отсутствием мутаций. Больший биологический интерес представляют наши семь пациентов с 98%-ной или большей гомологией зародышевого пути, которые не дали экспрессии ZAP-70. Креспо и коллеги²⁵ также выявили трёх пациентов из своей неизменённой группы, которые были ZAP-70-отрицательными. Это открытие говорит о том, что данные пациенты представляют реальное биологическое явление, а не технические трудности в измерении ZAP-70. Будет необходим длительный период наблюдения многих более противоречивых результатов, чтобы удостовериться в том, что является лучшим показателем их клинического течения - экспрессия ZAP-70 или мутационный статус генов IgVH. С возможным исключением редких случаев, в которых межклоновая диверсификация может быть достаточной, чтобы перевести пациента из неизмененной подгруппы в мутантную,²⁴ мутационный статус генов IgVH закреплён и, следовательно, полезен как прогностический маркер в начале заболевания, в отличие от хромосомных аномалий или экспрессии CD38, которые могут изменяться со временем. В настоящем исследовании мы не можем изменяться со временем. В настоящем исследовании мы не измеряли концентрацию белка ZAP-70 на момент первичного исследования. Тем не менее, из 20 пациентов, у которых серийные измерения были возможны, никто, кроме одного (с максимум только 15% ZAP-70) не показал никаких изменений по отношению к 2-3 годам наблюдения. Более крупные исследования с более длительным периодом наблюдения необходимы для подтверждения стабильности экспрессии ZAP-70, так же, как и в отношении времени и лечения. Если либо экспрессия ZAP-70, либо мутация генов IgVH были бы единственным прогностическим маркером в стадии А пациентов как критерий исследования для оценки интенсивной терапии вновь представленных бессимптомных индивидуумов с плохим прогнозом, то четыре пациента, имевшие стабильное заболевание после более чем 5 лет наблюдения, получили бы ненадлежащее лечение. Если использовались оба маркера, три пациента были бы неправильно классифицированы. Экспрессия ZAP-70 является неожиданным открытием в области B-клеточной опухоли, так как белок не поступает в нормально циркулирующие В-клетки. В-клетки используют связанный белок тирозинкиназы, Syk (тирозинкиназу селезёнки), который активируется через В-клеточный антигенно-рецепторный комплекс (BCR). Отсутствуют данные, указывающие на то, точно ли экспрессия ZAP-70 в ХЛЛ-подмножестве отражает экспрессию ZAP-70 в онтогенезе человеческих В-клеток или является следствием аномальной повышенной экспрессии в связи со злокачественностью, хотя ZAP-70 необходим для предварительного развития В-клетки развития у мышей с Syk-дефицитом.²⁵ В T-клетках функциональная значимость ZAP-70 показана обнаружением иммунодефицита у редких индивидуумов с мутациями ZAP-70.²⁶ Имеются доказательства того, что Syk и ZAP-70 функционально гомологичны²⁷ и что экспрессия ZAP-70 может восстановить BCR-функцию в Syk-отрицательных В-клетках.²⁸ Было показано, что Syk является важным в TCR-сигнализации у ZAP-70-дефицитных индивидуумов.²⁶ Некоторые исследования сигнализации путём BCR у ХЛЛ-пациентов^29,30 показали, что неизменённые ХЛЛ-В-клетки, экспрессирующие ZAP-70, провоцируют большее фосфорилирование цитозольных белков на BCR-стимуляции, чем это делали мутантные ZAP-70- отрицательные клетки.

Кроме того, перевязки BCR в ZAP-70 позитивных клетках привели к быстрому фосфорилированию ZAP-70 и его слиянию с поверхностью иммуноглобулина и CD79b, предполагая функциональную роль ZAP-70 в BCR-сигнализации. Если существуют важные различия в BCR-сигнализации между двумя мутационными подмножествами в ХЛЛ, исследование ZAP-70-отрицательных пациентов, с нормальными генами IgVH при прогрессирующей болезни могут вызывать различные отклонения этих сигнальных путей.
Остаются нерешёнными многие вопросы. Почему ZAP-70 экспрессируется в подмножестве ХЛЛ, а не в обычных В-клетках и не в других обычных В-клеточных формах рака, таких как фолликулярные лимфомы или диффузная большая клеточная лимфома? Почему экспрессия ZAP-70 так тесно связана с мутационным статусом генов IgVH?
Является ли ZAP-70 функциональным белком для ХЛЛ и способствует ли его повышенная экспрессия плохому прогнозу? Понятно, что требуется гораздо больше работы над экспрессией ZAP-70 в ХЛЛ, но наше исследование представляет собой успешный перевод открытий микроматричного анализа кДНК в анализе методом проточной цитометрии, которые могут широко использоваться и имеют достоверное прогностическое значение.

Участники
Д. Дж. Осайер и Л. Стаут разработали исходную концепцию исследования.
Дж. Э. Орчард и Р. Э. Ибботсон получили данные ZAP-70 проточной цитометрии ZAP-70.
Б. Уистнер, Э. Розенвалд и Л. Стаут провели микроматричный анализ ZAP-70.
З. Дэвис и Р. Э. Ибботсон исследовали статус генов IgVH. П. У. Томас провёл статистический анализ. Дж. Э. Орчард и Д. Дж. Осайер разрабатывали текст рукописи. Д. Дж. Осайер, Т. Дж. Хэмблин и Дж. Э. Орчард осуществляли клинический уход и записывали клинические данные."

Заявление о конфликте интересов

Никто не заявлял.

Благодарности
Эта работа финансировалась Борнмутским Фондом Исследований по лейкозу и Теновусом (Великобритания).