Применение лигандообменного капиллярного электрофореза для хиральнонго разделения a-гидроксикислот  и b-блокаторов

Аннотация

Для разделения двух классов веществ использован хиральный селектор комплекс N-(2-гидроксиoctyl)-L-4-гидроксипролин меди (II). Способ применен для хирального разделения a-гидроксикислот и лекарств, содержащих аминоспиртовую группу, таких как b-блокаторы.

Энантиоселективность сильно зависит от pH среды.

Введение

Комплекс металла использовался как добавка к ведущему электролиту.  На первых этапах в КЗЭ   использовали комплексы меди с гистидином или аспартамом, комплекс меди с  N,N-додецил-L-аланином   в сочетании  додецил сульфатом натрия. Последний подход применялся для хирального разделения данзил аминокислот.  a-гидроксикислоты разделяли используя комплексы меди с  L-4-гидроксипролином. Не удалось разделить алифатические аминокислоты используя L-пролин, или L-гидроксипролин изза высокой концентрации селектора в электоролите. Улучшение разделения произошло при использовании N-алкил производных гидроксипролина

Эксперимент

Диметилсульфоксид (DMSO), атролактиновая кислота, 3-гидрокси-

 -4-метоксиминдальная кислота, траловая кислота, b-блокаторы, L-4-гидроксипролин меди, 1,2 эпоксиоктан,3-гидроксиминдальная кислота, 4-бромминдальная кислота,  3 фенилмолочная кислота и  метанол, гидроксид натрия, фосфорная кислота, 3- этиламин, 3,4-дигидроксиминдальная кислота,  N-(2-гидроксиотил) L-4-гидроксипролин.

Раствор электролита готовят растворением сульфата меди и гидрокси-L-гидропролина в воде или5 мМрастворе фосфорной кислоты, необходимый уровень pH достигнут добавлением2 МNaOH. Триэтиамин добавляют для предотвращения выпадения осадка  гидроксида меди при выском значении pH.

Ввод пробы осуществлялся гидродинамически (10-50 мбар), время ввода  6 секунд (объем ввода  10-40 нл). Все ратсворы профильтрованы через0.2 ммфильтр  и дегазированы с гелием. Напряжение 15-28 кВ. Подвижность и электроосмотический поток определены введением ДМСО в тех же условиях. Разделение проводилось при комнатной температуре.

Оборудование

Система капиллярного электрофореза, УФ- детектор,  кварцевый капилляр (70*50)

Условия разделения

Для a-гидроксикислот

Электролит:10 мМL-гидроксипролин,5 мМсульфат меди (II),5 мМраствор фосфатного буфера при pH 4,3

Ввод пробы: 10 мбар*6 сек, капилляр:70 см(эфф.дл-26 см)*0,05 мм, напряжение 25-28 кВ.

Для b-блокаторов

Электролит:20 мМL-гидроксипролин,100 мМ  TEA, доведенный до pH=12 мМ  с помощью NaOH.   

Ввод пробы: 10 мбар*6 сек, капилляр:70 см(эфф.дл-26 см)*0,05 мм, напряжение 15 кВ.

Расчет данных разделения: Эффективная подвижность (ueff), selectivity factor (a) and разрешение (R ) рассчитаны по следующим уравнениям:

 Meff= 5mapp -2mEOF

Aeff= ueff2 /u eff1

 Rs=2(t2-t1)/w1+w2

Результаты:

Механизм разделения  в лигандообменном КЭ основан на образовании диастереомерным трехкомпонентным смешанным металлокомплексам образованным между лигандами хирального селектора и аналитами. Разрешение достигается благодаря различию в константах устойчивости смешанных комплексов  с энантиомерами аналита. Рассмотрим следующее равновесие.

Cu(L-Sel)2+ S–A стрелкиCu(L-Sel)(S–A)+L-Sel; 2  

Cu(L-Sel)2 +R–AстрелкиCu(L-Sel )(R–A)+L-Sel;

Sel-селетор

А-аналит

Разрешение a-гидроксикислот

Рис.1 показывает возможные структуры трехкомпонентных комплексов. Хотя еще не утверждены спектроскопические данные этих структур

Рис. 2 показывает изменение оптимального pH в  зависимости от класса веществ. Так в случае аминокислот оптимальное pH  для разделения гидроксикислот составляет 4.3. При pH 4.3 аминокислоты заряжены положительно, тогда как гидроксикислоты несут отрицательный заряд. Существует равновесие между свободным аналитом и смешанным комплексом. Подвижность аминокислот наложена на подвижность ЭОП. Формиру якомплекс с селектором, гидроксикислоты транспртируются к  катоду, но скоростью меньшей, чем скорость миграции аминокислот. Аналиты детектируются  a форме комплексов меди (II).

Из рис.3 виднотпорядок увеличения скоростей:кислота>ЭОП/селектор>a-гидроксикислота. Комплекс селектора нейтральный и мигрирует со скоростью ЭОП. Одновременное разделение амида и 3-(4-гидроксифенил)молочной кислоты используя ДМСО  как маркер ЭОП показано на рис.4

Поскольку подобранные условия являются оптимальными для разделения a-гидроксикислот а не аминокислот то амид не является основным определяемым компонентом в данных условиях.

Таблица 1 показывает данные для разделения a-гидроксикислот.

Самая высокая энантиоселективность наблюдается для кислот содержащих ароматическое кольцо. Алифатические гидроксикислоты не были разделены.  Траловая кислота и b-гидроксикислоты показали небольшое разделение. Разрешение зависит от заместителей в бензольном кольце.  Миндальная кислота дала высокое разрешение, но долгое время миграции. Время миграции уменьшается при наличии гидроксильной группы в бензольном кольце. Введение метоксигруппы увеличило время миграции.  По сравнению с 2-фенилмолочной кислотой, 3 фенилмолочная кислота дала более высокое разрешение. Rs=5.2. Наибольшее разрешение было у  3-(4-гидроксифенил) молочной кислоты (Rs=6.8). Время миграции было большим. Для уменьшения увеличивали напряжение и уменьшали эффетивную длину капилляра (менее26 см). Введение стандартных образцов энантиомеров показало, что сначала мигрирует D изомер, а затем L.  В случае L-гидроксипиридина , он группа боковой цепи участвует в комплексообразовании и таким образом увеличивает разрешение. В случае аминокислот не наблюдалось изменения порядка миграции энантиомеров  при добавлении SNS? Возможно потому, что аналиты и мицеллы имеют одиноковое время миграции. Но добавление цетилтриметиаммония бромида вместо SNS изменило порядок миграции за счет изменения направления ЭОП.

Разрешение аминоспиртов

Разделение аминоспиртов возможно при высоком значении pH. В раствор электролита добавляется триэтиламин для препятствия выпадению осадка гидроксида меди(II). Привысоком значении pH селектор заряжен отрицательно. Существует подвижное равновесие между свободным селектором и его комплексом. Комплекс нейтральный и мигрирует с ЭОП.  Аналиты мигрируют со скоростью меньшей, чем скорость ЭОП. Табл. 5 показывает влияние концентрации селектора на  разрешение.

Рис.6 показывает разделение метопролола.